(一)取卵前准备

    取卵前1天配制取卵用培养液、受精用培养液，抽滤矿物油，置37℃、5％C02培养箱中平衡过夜。以后每天所需培养用液皆需提前1天准备，平衡过夜。

    (二)找卵

    取卵时抽吸出的卵泡液通常前一段为透明淡黄色，后一段略呈血性。卵一冠一丘复合体(oocyte corona cumulus complex，OCCC)直径在1mm左右，可于保温状态下肉眼辨别或结合体视显微镜寻找。具体方法是：将卵泡液倒入无菌大平皿中，轻轻晃动，辨认直径3～5mm的黏液团，中间有一针尖大小的白点即为OCCC，辨认不清者在低倍镜下确认黏液团中有无OCCC。迅速将黏液团移入含Hepes的培养液中，防止pH值变动。漂洗干净红细胞，若有粘着的血块应尽量拔除干净，对黏液团过大者应适当去除部分颗粒细胞，再检查卵子成熟情况(表4．1)，然后移人授精用的培养液中，置37℃、5％C02培养箱中预培养。操作需要准确、轻柔、迅速。以取卵日为D0日。

    (三)处理津夜

    取卵后1～2小时留取津夜，置无菌平皿中于37℃条件下放置约30分钟，液化后首先检查津夜常规，然后改良上游法处理津夜。 

将津夜标本按l：l加入培养液以下，置37℃、5％C02培养箱内孵育30～60分钟，收集上层液，200转离心10分钟，弃上清液，轻弹试管底部使沉淀微松，小心加入培养液0．8ml，置37℃、5％C02培养箱内孵育30～60分钟，吸出上层云雾状精子液0．5ml做授精用。

    (四)授精

  根据卵子成熟情况进行预培养后授精，精卵比例为10万：l。培养液封油后置37℃、5％C02培养箱中培养过夜。亦有报道做短期授精，即授精后l小时将卵子取出漂洗后置新鲜培养液中封油过夜培养，与传统授精方法相比，授精率无显著性降低，且胚胎评分略高，可能是避免了精子对培养液营养成分的消耗及其释放代谢产物对卵子的不利影响。

 (五)检查卵子受精情况

  授精16～20小时后(D1日)，用机械法将卵子周围的颗粒细胞脱掉，换至胚胎培养液中，倒置显微镜下观察受精情况。双原核者为正常受精卵，还可见无原核、单原核与多原核者，应分开培养。无原核与单原核者可培养一段时间后再观察，有可能成为双原核卵。多原核卵不能用于移植。

  原核分级：根据核仁的大小、数目和分布情况可分为5级：

  l级：在原核相交处有数目相同的核仁排列成线，核仁数3～7个。

  2级：核仁的大小数目相同，但只在一个原核中的核仁排列成行，而另一原核中核仁分散排列。

  3级：原核中核仁的大小数目相等，但均匀分散于核质中。

  4级：原核未连接，原核大小不同或原核不在合子中央。

  5级：在一个原核中，核仁呈极(线)性排列，在另一个原核中，核仁呈散在排列。  

 (六)检查卵裂情况与挑选移植胚胎

    正常的胚胎发育速度为授精后48h(D2日)达4细胞胚，72h(D3日)达8细胞胚，96h(D4)达桑椹胚，120h(D5日)达囊胚期。胚胎移植时间根据胚胎的数目多少与胚胎的质量优劣而定。对于胚胎数量少或质量差者于D2日行胚胎移植，对于胚胎好且多者可培养至D3日或D5日。囊胚移植较8细胞胚移植而言，可在体外进行更多的筛选，为着床前遗传学诊断(PGD)工作提供了时间，但它会减少胚胎冷冻的机会，并有无囊胚可移植的风险，且妊娠率无显著性提高。所以8细胞胚胎移植更为实用。一般认为发育速度快、评分高的胚胎发育潜能更好，首先用于移植。为防止多胎妊娠的发生，胚胎移植数目通常限制在3个以内，随着促排卵与体外培养技术的不断进步以及对胚胎评价标准的不断完善，胚胎着床率会不断提高，最终使单胚胎移植成为可能。

 每一个胚胎应按其细胞数、碎片程度、对称性记录为下列形式：

   －－－CF一一S．一

  如：某胚胎为8CF4Sl，代表其为8细胞胚胎，碎片评分4分，对称性评分1分。

  (1)首先按囊胚扩张及孵化情况进行评分：共分6级。

  1级：早期囊胚，囊腔占整个囊胚的50％以下。

  2级：囊腔占整个囊腔的50％或50％以上。

  3级：囊腔占整满囊腔。

  4级：囊腔扩张，体积大于原来胚胎，透明带变薄。

  5级：正在孵化的囊胚，滋养细胞开始从透明带中穿出。

  6级：已孵化的囊胚，囊胚完全从透明带中孵化出来。

    (2)对3级和3级以上的囊胚再根据内细胞团和滋养细胞进行分级。内细胞团分级如下：

  A：许多细胞紧密排列。

  B：较少细胞松散排列。

  c：细胞很少。

  滋养细胞分级如下：

  A：许多细胞形成紧密上皮。

  B：较少细胞形成松散上皮。    ．

  c：只有很少的几个大细胞。

  例如，某囊胚评分为4AA，代表其为扩张囊胚，内细胞团与滋养细胞分级都为A级。